BACTERIOLOGIA DIAGNOSTICA

Describir la morfología colonial de cada bacteria en los medios sembrados y considerando los siguientes aspectos: Tamaño: (diámetro en mm) de la colonia.

Forma: puntiforme, circular, filamentosa, irregular, etc.

Elevación: plana, elevada, convexa, pulvinada o umbonada.

Margen: entero, ondulado, lobulado, dentado, filamentoso o encrespado.

Tipo de superficie: lisa, rugosa o granular.

Características ópticas: opaca o translúcida.

Producción de pigmentos.

• A partir de cada uno de los diferentes morfotipos coloniales observados en los distintos medios preparar un frotis y teñirlo por Gram. Hacer la correspondiente observación de la morfología microscópica.

• Inocular aquellos morfotipos coloniales que correlacionen con una morfología microscópica de bacilos Gram-negativos en Agar TSI inclinado utilizando el asa en punta. Inocular el medio hasta el fondo del tubo y luego en el inclinado. Sustituir el tapón de hule del tubo con el agar TSI por papel aluminio e incubar a 35^oC por 24 horas.

Generalidades de la familia Enterobacteriaceae

Las especies de la familia Enterobacteriaceae se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos que no forman esporas, móviles por flagelos peritricos o no móviles, crecen aeróbica o anaeróbicamente, la glucosa es metabolizada de forma fermentativa, producen la enzima catalasa, no tienen actividad de citocromo C oxidasa y reducen los nitratos a nitritos. De modo típico estos microorganismos producen en agar sangre colonias relativamente grandes, de color gris opaco, secas.

su diferenciación se basa principalmente en la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Los sustratos con los cuales pueden reaccionar estas enzimas se incorporan al medio de cultivo junto con indicadores que detectan la utilización del sustrato o la presencia de productos metabólicos específicos, estableciéndose así un perfil bioquímico para hacer la identificación de especie.

Generalidades de la familia Vibrionaceae.

La familia Vibrionaceae incluye los géneros Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y Photobacterium. Las diferentes especies de Vibrio y los otros géneros que se aíslan de muestras clínicas presentan características bioquímicas similares a las de los géneros de la familia Enterobacteriaceae, Pseudomonas y otros géneros relacionados.

Las especies de Vibrio se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos aerobios, con una estructura celular curva, tienen motilidad y poseen un flagelo polar, no forman esporas. Las especies de Vibrio crecen en presencia o ausencia de oxígeno. Todas estas especies producen la enzima citocromo C oxidasa (excepto la especie Vibrio metschnikovi), fermentan la glucosa y algunos producen gas. El cloruro de sodio estimula el crecimiento y algunas especies son estrictamente halofílicas.

 

Pruebas bioquímicas para la identificación de géneros y especies de la familia Vibrionaceae

Para la identificación bioquímica de las especies de la familia Vibrionaceae se deben realizar las mismas pruebas descritas para Enterobacteriaceae. Sin embargo, una vez realizado el aislamiento primario es esencial determinar si la bacteria es halofílica inoculando un caldo nutritivo conteniendo 0% y 3% de NaCl y se incuba a 35^oC por 18-24 horas. Si la bacteria crece en presencia de 3% de NaCl pero no crece en el medio con 0% de NaCl, se puede concluir que la bacteria es halofílica.

Generalidades de Pseudomonas y Burkholderia

Las especies pertenecientes a los géneros Pseudomonas y Burkholderia son en general catalasa y oxidasa positivas. Morfológicamente indistinguibles al Gram, se presentan como bacilos Gram negativos rectos o ligeramente curvos. Su tamaño oscila entre 1 a 5 μm de largo y 0.5 a 1 μm de ancho. Son aerobios, aunque algunas cepas pueden crecer bajo condiciones anaeróbicas usando el nitrato como aceptor final de electrones. No forman esporas y son móviles con 1 o más flagelos polares a excepción de B mallei, el cual no es móvil. Estos grupos tienen requerimientos nutricionales mínimos y crecen en agar MacConkey como no fermentadores de lactosa.

este patógeno es particularmente importante en infecciones intrahospitalarias. Como son agentes patógenos oportunistas, pueden producir infecciones serias en pacientes con compromiso inmunológico; convirtiéndose así en agentes importantes de infecciones nosocomiales. La virulencia de éstos agentes radica en su capacidad de colonizar varios sitios anatómicos humanos, la propiedad para invadir tejidos y producir daño tisular. Además de la tendencia característica de invadir torrente sanguíneo.

Otras especies de bacilos no fermentadores

A las pruebas de escrutinio que se utilizan para su identificación como morfología microscópica, oxidasa, movilidad, producción de indol y acidificación de carbohidratos, se le han agregado pruebas como el crecimiento a temperatura ambiente y crecimiento en medios selectivos como el agar MacConkey. Algunas cepas solamente crecen a temperatura ambiente y son incapaces de crecer en agar MacConkey. En este grupo se encuentran géneros como Acinetobacter, Moraxella, Eikenella, Flavobacterium, Alcaligenes (Achromobacter), Actinobacillus, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Stenotrophomonas y Kingella, entre otras de menor importancia médica.

Pseudomonas aeruginosa es la especie más frecuentemente aislada del grupo de bacilos Gram-negativos no fermentadores, seguida de Acinetobacter spp. y Stenotrophomonas maltophilia. Estos dos últimos agentes se caracterizan por producir infecciones intrahospitalarias y en su gran mayoría se asocian al uso de respiradores o al implante de catéteres. Como una característica importante, estos dos agentes presentan una elevada resistencia natural a los antibióticos y son capaces de adquirir resistencia contra otros antibióticos con facilidad. Por lo anterior, estos agentes son importantes en el ambiente hospitalario y son cada vez más frecuentes los aislamientos de estas bacterias produciendo infecciones severas.

Las especies de Acinetobacter se caracterizan por ser bacilos pequeños o bien cocobacilos, son no móviles, oxidasa negativa y pueden tener una morfología en pares (diplococo). Sus colonias en agar sangre no son característicos (producen colonias planas, opacas y pequeñas), crecen bien en agar MacConkey, pero con colonias de pequeño tamaño, incoloras o bien escasamente pigmentadas de rosado.

En infecciones vaginales, es importante descartar la presencia de Acinetobacter spp. ya que puede presentar una morfología semejante Neisseria gonorrhoeae. La diferenciación se puede hacer mediante la prueba de crecimiento en agar MacConkey y la prueba de citocromo C oxidasa. A diferencia de Acinetobacter spp, Neisseria gonorrhoeae no crece en MacConkey y es oxidasa positivo. Las especies de Acinetobacter están ampliamente distribuidas en la naturaleza tanto en ambientes húmedos como en superficies secas y pueden ser parte de la flora normal de la piel y mucosas de los seres humanos. Las especies mas frecuentes aisladas son A.baumannii, A. iwoffi, A. haemolyticus, y A. johnsonii.

Las especies de Moraxella son cocobacilos oxidasa positiva, no móviles y se presentan como asacarolítico porque es inerte a los carbohidratos. Estas especies pueden encontrarse como flora normal de piel y mucosas. Se ha demostrado que por lo menos Moraxella osloensis, M. liquefaciens y M. lincolnii son flora normal de vías respiratorias humanas, aunque rara vez se encuentran produciendo bacteremia, endocarditis, conjuntivitis y meningitis. Moraxella catarralis es frecuente en infecciones óticas en niños. Oligella spp. son un grupo de cocobacilos, siendo las especies más importantes de este grupo Oligella urethralis y Oligella ureolytica, que se han encontrado produciendo infecciones urinarias. Eikenella spp. son también flora normal gingival e intestinal. La especie más importante es Eikenella corrodens, un bacilo Gram negativo oxidada positivo, se ha encontrado produciendo infecciones locales por mordeduras humanas.

Generalidades del género Haemophilus

El género Haemophilus se compone de cocobacilos Gram negativos anaerobios facultativos. Su crecimiento es generalmente óptimo cuando se incuba a 33-37°C en una atmósfera con 5-10% de CO₂. A la mayoría de las especies se les considera nutricionalmente fastidiosas porque requieren para su crecimiento medios enriquecidos con NAD (factorV) y/o hemina (factor X), por lo que usualmente no crecen en agar sangre, el cual contiene adecuadas cantidades de hemina pero contiene factor V únicamente dentro de los eritrocitos. Sin embargo, Haemophilus puede crecer en agar sangre alrededor de otras bacterias, como Staphylococcus aureus, que proporcionen el factor V. A este fenómeno se le conoce como satelitismo. Las especies de Haemophilus pueden presentar además pleomorfismo celular, dependiendo de la edad del cultivo y el medio que se utiliza. En los cultivos más viejos se observan células bacterianas con formas bacilares, mientras que en los cultivos más jóvenes se encuentran formas cocoides o cocobacilares.

Características del género Neisseria

El género Neisseria incluye bacterias con morfología de diplococcos Gram-negativos con una reacción positiva a las pruebas de oxidasa y catalasa. Conjuntamente con los géneros Moraxella (incluyendo Branhamella catarrhalis, actualmente Moraxella catarrhalis), y Kingella conforman la familia Neisseriaceae. Algunas de las características que permiten diferenciar entre los géneros de la familia Neisseriaceae se muestran en el cuadro 3. En el género Neisseria, el cual tiene la mayor importancia clínica dentro de la familia Neisseriaceae, se incluyen las siguientes especies: N. gonorrhoeae , N. meningitidis.

Los diplococos Gram negativos del género Neisseria se asemejan a granos de café y algunos producen cápsula. Las especies de Neisseria se caracterizan por ser de metabolismo aerobio y el crecimiento de las especies patógenas se ve favorecido mediante incubación en una atmósfera altamente húmeda y enriquecida a 5-8% de CO₂. Su temperatura de crecimiento es óptima entre los 35-37^oC y tienen requerimientos nutricionales complejos. Algunas especies son capaces de degradar unos pocos carbohidratos, mientras que otras son completamente incapaces de hacerlo, mientras que las especies saprófitas, especialmente, producen pigmentos carotenoides.

Las especies patógenas primarias para el ser humano son N. gonorrhoeae y N. meningitidis. N. gonorrhoeae es nutricionalmente mucho más exigente que N. meningitidis, de manera tal que puede crecer únicamente en medios enriquecidos como agar chocolate, pero no puede crecer en agar sangre, mientras que N. meningitidis puede crecer tanto en agar sangre como en agar chocolate.

Características del género Campylobacter.

En la familia Campylobacteriaceae se incluyen los géneros Campylobacter y Arcobacter. Las especies de Campylobacter se caracterizan por ser bacilos Gram-negativos curvos, en forma de S o de espiral, con un tamaño de 0.2-0.9 μm x 0.5-5.0μm, son no esporulados, móviles por un flagelo en uno o ambos polos de la célula y microaerofílicos (5% 0₂ - 10% CO₂ - 85% N₂). Las especies del género Campylobacter asociadas a infecciones en el ser humano incluyen:

De las especies mencionadas, C. jejuni subsp. jejuni y C. coli, conjuntamente con C. fetus subsp. fetus, son los tres agentes más frecuentemente asociados a infecciones en el ser humano. C. jejuni subsp. jejuni y C. coli son responsables de infecciones intestinales y clínicamente indistinguibles.

La identificación presuntiva de las especies de Campylobacter se basa en unas pocas características iniciales, incluyendo su crecimiento en condiciones microaerofílicas a 42^oC en medios selectivos, su morfología microscópica cuando se tiñen por Gram y la prueba de oxidasa positiva.

Características del género Helicobacter

En el género Helicobacter se incluye la especie H. pylori, una bacteria que habita en la mucosa gástrica del ser humano, así como H. cinaedí y H. fennelliae, cuyo habitat natural es la mucosa intestinal.

BACILOS GRAM POSITIVOS

Características del género Listeria

El género Listeria incluye bacilos Gram-positivos cortos, no esporulados, que aparecen solos o en cortas cadenas. Las colonias son pequeñas, lisas y de color gris. Las especies del género Listeria crecen en un rango de temperatura de 1-45^oC, con una temperatura óptima entre 30 y 37^oC, y producen colonias pequeñas, lisas y de color grisáceo. Tienen la capacidad de crecer en un rango de pH de 5.5-9.5 y a una concentración de NaCl de hasta 10%. Su metabolismo es anaerobio facultativo. Las especies de Listeria presentan un movimiento rotatorio de un extremo a otro a temperatura ambiente (22-25^oC), pero no a 37^oC. La gran mayoría de los aislamientos son catalasa-positiva y oxidasa-negativa. La clasificación antigénica se basa en la tipificación de los antígenos O y H.

Características del género Erysipelothrix.

El género Erysipelothrix incluye bacilos Gram-positivos, no-esporulados, no-móviles, que tienden a formar filamentos largos en cultivos viejos. El género Erysipelothrix abarca las especies E. rhusiopathiae y E. tonsillarum, de las cuales únicamente la primera se asocia a infecciones en el ser humano, como infecciones en piel, endocarditis, septicemia y artritis.

Características del género Corynebacterium

El género Corynebacterium está constituido por un gran número de especies con gran heterogeneidad genética y fenotípica, y se caracterizan por ser bacilos Gram-positivos, pleomóficos, no-esporulados, no-encapsulados, no-móviles, que pueden presentar gránulos metacromáticos visibles mediante tinción con azul de metileno. Las especies de Corynebacterium son catalasa-positiva y están ampliamente distribuidas en el ambiente, pudiéndose encontrar en suelos y agua, como también constituyen parte importante de la flora normal en piel y mucosas del ser humano y de animales.

La especie más importante es C. diphteriae, la cual es el agente responsable de la difteria, una infección del tracto respiratorio superior con efectos sistémicos debido a la producción de la toxina diftérica. La toxina diftérica se encuentra genéticamente codificada por un bacteriófago temperado, por lo cual no todos los aislamientos de C. diphteriae son toxigénicos. C. diphteríae también puede causar difteria cutánea en piel traumatizada.

STAPHYLOCOCCUS

1. Características del género Staphylococcus

En el género Staphylococcus se incluyen bacterias Gram-positivas.

El diámetro de una célula individual de Staphylococcus es de 0.7 a 1.2 μm. Típicamente, los Staphylococcus muestran una reacción positiva a la tinción de Gram. Sin embargo, células en cultivos viejos o ingeridas por fagocitos pueden mostrarse como Gram-negativos. La clásica morfología de racimos de uva es más evidente en cultivos sobre medios sólidos. Esta morfología se debe a que los Staphylococcus se dividen en tres planos perpendiculares sucesivos y a que las células hijas no se separan completamente. En medios líquidos es posible observar cadenas cortas, a diferencia de los Streptococcus, los Staphylococcus raramente forman cadenas conteniendo más de cuatro células. Los Staphylococcus, son no móviles, carecen de flagelos y no forman esporas. Ciertas cepas tienen la capacidad de producir una cápsula extracelular de polisacáridos.

La mayoría de las especies del género Staphylococcus son bacterias no fastidiosas que crecen relativamente bien en medios de cultivo sencillos como agar sangre, agar nutritivo, agar tripticasa soya y otros. Las colonias individuales de Staphylococcus crecidas sobre agar nutritivo son opacas, con bordes definidos, circulares, convexas y de 1 a 4 mm en diámetro. El clásico color amarillo oro de las colonias de S. aureus es debido a la presencia de carotenoides (aureus en latín significa oro). La pigmentación es usualmente aparente luego de 18-24 horas de incubación a 37^oC, pero es más pronunciada cuando los cultivos son mantenidos a temperatura ambiente for 24-48 horas adicionales.

La pigmentación colonial no es una propiedad exclusiva de S. aureus, sino que está también presente en otras especies del género incluyendo a S. arlettae, S. chromogenes, S. haemolyticus y otras.

Los cocos Gram-positivos aislados de muestras clínicas deben ser inicialmente analizados por la producción de la enzima catalasa. Esta es una prueba muy sencilla pero fundamental para distinguir dos grandes grupos: cocos Gram-positivos catalasa-positivos que incluyen Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus, y cocos Gram-positivos catalasa-negativos con Streptococcus, Enterococcus, Aerococcus y Planococcus entre otros.

En caso de duda, se puede realizar la prueba de resistencia a la bacitracina, en la cual los Staphylococcus se muestran resistentes, mientras que Mícrococcus y Stomacoccus son sensibles. Adicionalmente las especies S. sciuri, S. lentus y S. caseolyticus tienen citocromos tipo c y son, por lo tanto, oxidasa-positivos. Sin embargo, estas tres especies tienen poca importancia clínica.

STREPTOCOCCUS Y ENTEROCOCCUS

1.       Clasificación taxonómica de la “familia Streptococcaceae”

En los esquemas taxonómicos tradicionales la “familia Streptococcaceae” incluye cocos Gram-positivos, catalasa-negativos que tienden a crecer en pares o en cadenas, los cuales se diferencian de la familia Micrococcaceae (Staphylococcus y Micrococcus) por cuanto estos últimos son catalasa-positivos. Sin embargo, estudios filogenéticos recientes cuestionan la posición taxonómica real de la “familia Streptococcaceae” y han aumentado considerablemente los géneros y las especies relacionadas a Streptococcus. La mayoría de los géneros relacionados a Streptococcus tienen un metabolismo anaeróbico facultativo (ver cuadro 1), en donde los géneros Streptococcus y Enterococcus son importantes patógenos para el ser humano y animales. Algunos otros géneros muestran un metabolismo anaeróbico estricto, de los cuales, únicamente los géneros Peptococcus y Peptostreptococcus se encuentran en infecciones en el ser humano.

2.       Características del género Enterococcus

El género Enterococcus incluye a bacterias que son cocos Gram-positivos que se encuentran solos o formando parejas o cadenas cortas similares a los Streptococcus, pero que pueden mostrarse en formas cocobacilares cuando son cultivadas en medios sólidos. Las especies de Enterococcus crecen a una temperatura óptima de 35oC, pero la mayoría de las especies pueden crecer entre 10°C y 45oC, crecen en caldo tripticasa soya (CTS) conteniendo 6.5% de NaCl e hidrolizan la esculina en presencia de sales biliares. Algunas especies de Enterococcus son móviles. La expresión de un fenotipo hemolítico es altamente variable entre las diferentes especies de Enterococcus así como entre cepas de una misma especie. Por ejemplo, algunas cepas de E. faecalis son ß-hemolíticas en medios con sangre de conejo o caballo, pero no hemolíticas en medio con sangre de oveja. Enterococcus es un grupo de bacterias muy resistentes que pueden sobrevivir en ambientes muy adversos lo que les permite encontrarse casi en cualquier parte de la naturaleza como en suelo, agua, alimentos, animales, aves e insectos. Diferentes especies de Enterococcus pueden encontrarse formando parte de la flora normal del tracto gastrointestinal y tracto genitourinario del ser humano y muchos animales. Las especies clínicamente más importantes son E. faecalis y E. faecium, con frecuencias de aislamiento de infecciones por Enterococcus de 80-90% y de 10-15%, respectivamente. Estas especies de Enterococcus son responsables aproximadamente del 10% del total de las infecciones urinarias y del 16% de las infecciones urinarias de origen nosocomial. Adicionalmente, las especies de Enterococcus son importantes en las infecciones intraabdominales o pélvicas y de bacteremias, las cuales se presentan en pacientes inmunocomprometídos o con enfermedad grave que requieren de hospitalización prolongada. La bacteremia puede llevar a endocarditis, en donde la especie E. faecalis es el agente más común en los casos de endocarditis por Enterococcus.

Actividad hemolítica. La hemólisis observada en los aislamientos de Streptococcus y Enterococcus en diferentes muestras clínicas es una de las primeras características sugestivas de posibles especies. Algunas especies muestran una hemólisis completa (hemólisis ß) alrededor de las colonias en agar sangre, como S. pyogenes, S. agalactiae (aunque algunos aislamientos aparecen como no-hemolíticos), Streptococcus de los grupos C, F y G, así como algunas cepas de Enterococcus, aunque, como se indicó anteriormente, el fenotipo hemolítico en Enterococcus es muy variable. Otras especies pueden mostrar una hemólisis incompleta (hemólisis alfa) alrededor de las colonias en agar sangre, incluyendo S. pneumoniae, Streptococcus del grupo D y del grupo viridans.

Prueba de CAMP (Christie, Atkins, Munch-Petersen). La prueba de CAMP se utiliza para la identificación presuntiva de S. agalactiae (grupo B de Lancefield). En esta prueba se observa un efecto sinérgico que se produce al interactuar el factor CAMP producido por cepas de S. agalactiae con la hemolisina β de Staphylococcus aureus. Ambos son productos extracelulares que difunden en el medio de cultivo para producir

Prueba de hidrólisis de esculina. Esta prueba se utiliza para la identificación presuntiva de Streptococcus del grupo D, como S. bovis y S. equinus, y de las especies de Enterococcus, todos los cuales dan esta prueba positiva. Esta prueba se realiza utilizando un medio llamado agar bilis-esculina, el cual contiene 4% de sales biliares y 1% de esculina. La hidrólisis de la esculina resulta en la formación de glucosa y esculetina. La esculetina en presencia de Fe3+ forma un complejo de color negro. Por lo tanto, las bacterias que crecen en presencia de las sales biliares e hidrolizan esculina tornan el medio de color negro, generalmente en un periodo de incubación de 18-24 horas a 35-37oC. La presencia de crecimiento pero sin la formación del color negro se considera como una prueba negativa. Prueba de crecimiento (tolerancia) en 6.5% de NaCl. Esta prueba permite diferenciar las especies de Enterococcus (crecimiento positivo en presencia de 6.5% de NaCl) de los Streptococcus del grupo D (crecimiento negativo en presencia de 6.5% de NaCl). El microorganismo en estudio se inocula en un caldo tripticasa soya conteniendo 6.5% de NaCl. Luego de un periodo de 18-24 horas a 35-370C se observa la presencia o ausencia de crecimiento en el medio de cultivo. Prueba de resistencia al optochin. La prueba de resistencia al optochin (hidrocloruro de hidrocupreína) permite la diferenciación de Streptococcus pneumoniae (sensible al optochin) de otros Streptococcus α- hemolíticos como los Streptococcus del grupo viridans (resistentes al optochin). Para la realización de esta prueba el microorganismo en estudio debe ser inoculado densamente en una placa de agar sangre y sobre el inóculo se coloca un disco conteniendo optochin (rotulado con una P), el cual se presiona levemente para que se adhiera a la superficie del medio. Las placas de agar sangre son posteriormente incubados a 35-37oC por un período de 18-24 horas en una atmósfera enriquecida con CO2. La mayoría de los discos conteniendo optochin disponibles comercialmente tienen un diámetro de 6 mm. Utilizando estos discos de 6 mm para la prueba de resistencia al optochin, un resultado se considera negativo (susceptible) cuando el halo de inhibición mide al menos 14 mm de diámetro.

Prueba de resistencia a la bacitracina. La prueba de resistencia a la bacitracina se utiliza para la diferenciación presuntiva de Streptococcus β-hemolíticos del grupo A de Lancefield (S. pyogenes) de otros Streptococcus β- hemolíticos. S. pyogenes se muestra sensible a la bacitracina mientras que otros Streptococcus β-hemolíticos son generalmente resistentes a la bacitracina.

La presencia de cualquier halo de inhibición se considera como negativo (susceptible), mientras que el crecimiento bacteriano hasta el borde del disco se considera como positivo (resistente).

PRUEBAS SEROLOGICAS EN BACTERIOLOGIA

1.       Rosa de bengala

Las pruebas serológicas son las herramientas más útiles para evaluar la epidemiología de la brucelosis y la eficacia de los programas de vacunación. Los métodos más comúnmente usados incluyen aglutinación, fijación de complemento, inmunodifusión en gel e inmunoensayos enzimáticos. Actualmente, mediante la combinación de una buena información clínico-epidemiológica, junto con el uso de pruebas serológicas presuntivas y confirmatorias, se obtienen mejores resultados en el diagnóstico preliminar de casos sospechosos. Es importante además capacitar al personal médico y de laboratorio, ya que la brucelosis es una entidad de origen insidioso, difícil de identificar, y representa un riesgo de contaminación a nivel de laboratorio si no se siguen procedimientos apropiados con personal conciente del peligro de esta infección bacteriana.

Procedimiento Animales 1. Colocar una gota de 15 a 30 μl de cada suero en la placa 2. Colocar una gota de 15 a 30 μl de Rosa Bengala a la par de cada suero 3. Mezclar con el aplicador para homogenizar 4. Agitar manualmente o en agitador por 5 a 10 minutos Humanos 1. Hacer diluciones dobles seriadas hasta 1:64 con solución salina o PBS 2. Diluir el antígeno 1:5 con PBS 3. Colocar 15 a 30 μl de cada dilución junto a una cantidad igual de antígeno diluido en la placa 4. Mezclar y agitar de la misma forma que el procedimiento anterior

Interpretación No aglutinación: ausencia de anticuerpos Aglutinación visible: presencia de anticuerpos

2.       Antiestreptolisina O (ASO)

La estreptolisina O (SO), es una de las toxinas producidas por bacterias del género Streptococcus pyogenes, o estreptococos beta hemolíticos del grupo A de Lancefield. Es una citolisina lábil al oxígeno y sensible a colesterol. Debido a la inmunogenicidad de la toxina, es posible determinar los anticuerpos en el suero de pacientes que han estado en contacto con esta bacteria Gram positiva. En personas sanas se pueden encontrar títulos bajos de anticuerpos contra SO, sin embargo, un aumento en el título es indicativo de una infección activa (reciente) como amigdalitis, escarlatina, sepsis puerperal o erisipela.

El presente método se basa en la detección de anticuerpos anti-estreptolisina O en suero por su reacción contra la SO adsorbida sobre un soporte inerte de látex, lo que produce una aglutinación visible microscópicamente.

Procedimiento Prueba cualitativa

Reactivo de látex (Wiener Lab): suspensión de partículas de látex poliestireno recubiertas con estreptolisina O.

1. Agitar el reactivo látex varias veces con el gotero

2. Colocar una gota (50 μl) de suero junto a 50 μl de reactivo látex en la placa

3. Mezclar con aplicador hasta homogenizar

4. Agitar por dos minutos y leer

Prueba semicuantitativa

1. Los sueros positivos en la prueba cualitativa se diluyen seriadamente en viales plásticos o de vidrio con salina o PBS hasta 1:64.

2. Repetir el procedimiento anterior Interpretación No aglutinación: suspensión se mantiene homogénea Aglutinación visible: presencia de anticuerpos ASO Título: inverso de la máxima dilución a la que se observa una aglutinación visible ASO (UI/ml) = título × sensibilidad de la reacción (200 UI/ml).

3.       Prueba para el diagnostico presuntivo de sífilis (VDRL)

La sífilis es una enfermedad preferentemente de transmisión sexual causada por la espiroqueta Treponema pallidum, que invade las mucosas intactas o la piel con abrasiones leves. La detección y tratamiento de la enfermedad en etapas tempranas es fundamental a fin de evitar complicaciones graves como sífilis cardiovascular, neurosífilis y sífilis congénita. Los anticuerpos inespecíficos o también conocidos como no-treponémicos o reagínicos, se presentan en pacientes sifilíticos y están dirigidos contra componentes propios, específicamente de naturaleza lipídica; mientras que los treponémicos o específicos reconocen tanto el T. pallidum como cepas de bacterias muy relacionadas a este género. La prueba de VDRL (siglas del inglés Venereal Disease Research Laboratory) es una técnica que detecta anticuerpos anti-cardiolipina, los cuales se pueden encontrar en embarazo, así como en infecciones agudas o crónicas (malaria, tuberculosis, lepra, brucelosis, artritis, cáncer, diabetes, lupus y otras enfermedades autoinmunes). El principio de esta técnica se basa en la floculación de suspensión antigénica (cardiolipina-lecitina-colesterol) con cuando se mezcla con los anticuerpos reagínicos del suero.

Procedimiento Prueba cualitativa

1. Colocar 50 μl de suero en un anillo de la lámina con micropipeta

2. Agregar una gota de la suspensión del antígeno con el gotero calibrado

3. Poner a rotar las láminas por 4 minutos a 180 rpm.

4. Observar al microscopio sin carro y aumento de 100X con la máxima iluminación.

Prueba semicuantitativa

1. Preparar diluciones dobles seriadas del suero hasta 1:32 en solución salina.

2. Realizar el procedimiento anterior

Interpretación R (reactivo): grumos grandes y medianos

DR (débilmente reactivo): grumos pequeños

NR (no reactivo): grumos ausentes

Título: inverso de la máxima dilución que se observe reactiva

PROCESAMIENTO DE UROCULTIVOS

1. Consideraciones generales sobre las infecciones del tracto urinario

La orina dentro del tracto urinario normal es estéril y los microorganismos llegan a colonizar solamente las porciones distales de la uretra. La orina, al pasar por las porciones distales de la uretra durante la micción, se puede contaminar con las bacterias comensales. El número de bacterias presentes en la orina recién recolectada de una persona saludable es relativamente bajo, usualmente ≤ 102 UFC/ml.

2. Factores de virulencia bacterianos asociados a las infecciones urinarias Las bacterias causantes de infecciones urinarias generalmente provienen del tracto intestinal donde forman parte de la flora normal. Las cepas uropatogénicas se caracterizan por poseer una serie de factores de virulencia que las distinguen de otras cepas bacterianas intestinales no patógenas. Dentro de estas características se deben considerar las siguientes:

• Motilidad bacteriana. Con notables excepciones como Staphylococcus saprophyticus, especies de Klebsiella y Enterococcus, la gran mayoría de las bacterias uropatógenas tienen la capacidad de moverse ascendentemente por la uretra hacia la vejiga urinaria. En efecto, las cepas uropatógenas de Escherichia coli y las especies de Proteus tienen una alta capacidad de motilidad ascendente, en forma contracorriente a la orina, lo cual facilita grandemente la colonización de la vejiga urinaria.

• Producción de adhesinas. Las cepas uropatógenas de Escherichia coli tienen la capacidad de producir diferentes estructuras de adhesión denominadas adhesinas, siendo las más importantes las fimbrias tipo 1 y las fimbrias tipo P. Las fimbrias tipo 1 son producidas por un gran porcentaje de cepas de Escherichia coli y de otras especies de la familia Enterobacteriaceae. Las fimbrias tipo 1 median la adhesión a residuos de manosa localizados sobre la mucosa intestinal y sobre la mucosa vesical. Se asume que las fimbrias tipo 1 son responsables de la colonización de la vejiga urinaria y permiten el establecimiento de las infecciones de las vías urinarias bajas (cistitis). Las fimbrias tipo P reconocen residuos de digalactósido (Gal-Gal) localizados en la superficie de la pelvis renal y, por lo tanto, se presume que las fimbrias tipo P median la colonización de dicho sitio anatómico facilitando el establecimiento de infecciones de las vías urinarias altas (pielonefritis). Las fimbrias tipo P solamente se encuentran solamente en ciertas cepas de Escherichia coli denominadas pielonefrogénicas.

• Producción de ureasa. La producción de una enzima con actividad urealítica es frecuente en muchos uropatógenos de origen intestinal, incluyendo Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, Providencia stuartii y Staphylococcus saprophyticus. La hidrólisis de urea incrementa la concentración de amonio en la orina con la subsiguiente elevación del pH urinario. El pH urinario elevado puede llevar a una serie de efectos importantes incluyendo la formación de cálculos debido a la precipitación de sales de fosfato de magnesio y amonio. La formación de cálculos puede provocar la obstrucción de las vías urinarias e interferir con la micción y favorece el establecimiento de las infecciones bacterianas. Adicionalmente, la alcalinización de la orina por la generación de amonio favorece la multiplicación y la sobrevivencia bacteriana en el tracto urinario, probablemente porque se logra un pH más adecuado para el crecimiento bacteriano, se obtiene amonio a concentraciones elevadas como una fuente de nitrógeno más asimilable y el amonio puede inactivar el cuarto componente del complemento y prevenir así algunas funciones del sistema inmunológico.

• Producción de hemolisinas. La gran mayoría de las especies bacterianas aisladas de infecciones en el tracto urinario son hemolíticas cuando se observa su morfología colonial sobre placas de agar sangre. El caso más estudiado es el de la hemolisina de Escherichia coli, una citolisina formadora de poros que tiene la capacidad de interactuar y muchas veces lisar diferentes tipos de células del hospedero. La lisis de los eritrocitos provoca la liberación hemoglobina, la cual sirve como una fuente de hierro, un elemento esencial para la multiplicación bacteriana. Adicionalmente, la interacción de la hemolisina sobre células nucleadas puede alterar la fisiología celular, de manera que se inhiben muchas funciones de leucocitos polimorfonucleares y otras células de respuesta inflamatoria. Tales efectos inhibitorios bloquean la actividad del sistema inmunológico y favorecen entonces la multiplicación de las bacterias en el tracto urinario. Por otra parte, la hemolisina de Escherichia coli puede tener un efecto tóxico sobre las células uroepiteliales y del parénquima renal, provocando así un daño directo adicional. Otros casos menos estudiados incluyen las hemolisinas de Proteus mirabilis y Proteus vulgaris, las cuales muestran una gran homología con la hemolisina de Escherichia coli, la hemolisina de Serratia marcescens y la toxina a de Staphylococcus aureus, entre otras.

• Producción de endotoxinas. El lipopolisacárido (LPS), un componente estructural de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas, tiene un efecto tóxico directo sobre células de respuesta inflamatoria como leucocitos polimorfonucleares, células monocíticas y linfocitos T y B, alterando la producción de una serie de citoquinas involucradas en la respuesta inmunológica. El LPS es uno de los principales inductores de fiebre en los individuos con infecciones bacterianas en las vías urinarias superiores. Otros componentes estructurales bacterianos, como fragmentos de pared celular y ácidos teicoicos provenientes de bacterias Gram-positivas, tienen efectos muy similares a los producidos por el LPS de bacterias Gram-negativas.